一种生产7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的方法及其专用培养基，用该培养方法及其专用培养基可以获得产7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的愈伤组织，愈伤组织中7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的含量为0.005%-0.009%。本发明是第一次在红豆杉植物中通过细胞工程方法获得7-木糖-10-去乙酰紫杉醇。生产的7-木糖-10-去乙酰紫杉醇可以作为原料通过简单工艺转化为紫杉醇。本发明解决了紫杉醇生产上的原料问题，易操作、周期短，成本低，保护了红豆杉植物资源。
1.一种基本培养基，其特征在于：该培养基的配方为：NH₄NO₃xa01100-1300mg，KNO₃xa01800-2000mg，KH₂PO₄xa0320-360mg，CaCl₂·2H₂Oxa0420-460mg，MgSO₄·7H₂Oxa0350-380mg，FeSO₄·7H₂Oxa026-29mg，Na₂-EDTAxa036-38mg，MnSO₄·4H₂Oxa02.0-2.5mg，H₃BO₃xa00.5-0.7mg，KIxa00.7-0.9mg，Na₂MoO₄·2H₂Oxa00.02-0.03mg，CuSO₄·5H₂Oxa00.002-0.003mg，CoCl₂·6H₂Oxa0
0.002-0.003mg,Zn·Na-EDTAxa012-17mg，盐酸硫胺素0.4-0.6mg，烟酸
0.4-0.6mg，盐酸吡哆醇0.4-0.6mg，甘氨酸1-3mg，用水定容至1L，pH5.6-5.8。
2.利用权利要求1所述培养基生产7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的方法，其特征在于：该方法步骤如下：1）无菌条件下，将红豆杉的外植体在体积百分浓度70%的乙醇中消毒30s，再将其置于质量百分浓度为10%的次氯酸钠中杀菌20min，用无菌水冲洗3次，接种前将外植体切成长度为5mm的小段，将其接种于愈伤组织诱导培养基中在24℃，黑暗条件下诱导愈伤组织；2）将愈伤组织接种于继代培养基中在24℃，黑暗条件下进行继代培养。
3.按照权利要求2所述生产7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的方法，其特征在于：所述愈伤组织诱导培养基为在权利要求1所述的基本培养基的基础上添加2,4-Dxa01-7mg，蔗糖20-50g，琼脂5-8g/L。
4.按照权利要求2所述生产7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的方法，其特征在于：所述继代培养基为在权利要求1所述的基本培养基的基础上添加2,4-Dxa01-5mg，蔗糖20-50g，琼脂5-8g/L。
5.按照权利要求2所述生产7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的方法，其特征在于：所述红豆杉为南方红豆杉、云南红豆杉或中华红豆杉。
6.按照权利要求2所述生产7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的方法，其特征在于：所述外植体为茎、针叶或雄花。
7.按照权利要求2所述生产7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的方法，其特征在于：所述步骤2）中的继代培养周期为3-4周，至少继代4次。技术领域
本发明属于植物细胞工程领域，具体涉及一种生产7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的方法及其专用培养基。
背景技术
紫杉醇（1）作为临床一线抗癌用药，目前被广泛用于卵巢癌、乳腺癌、肺癌等多种实体癌的治疗。目前规模化生产紫杉醇的途径主要是从红豆杉属植物中直接提取或提取其半合成前体——10-去乙酰巴卡亭III（2），再通 ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/> 过合成手段合成紫杉醇。最近，以7-木糖-10-去乙酰紫杉醇（3）作为原料，合成紫杉醇的工艺被陆续开发出来（US5412116，US6028206，US5856532，US6437154，ZL200610046296.6和ZL200610047743.X）。7-木糖-10-去乙酰紫杉醇与紫杉醇同属三环二萜类化合物，在南方、云南和中华红豆杉枝叶中广泛存在，该化合物与紫杉醇的差别仅在于C-7位多一个木糖基，C-10位缺少一个乙酰基，因此如果通过有效方法去除C-7木糖基，并在C-10引入乙酰基，就可以将其转化为紫杉醇，从而达到对我国红豆杉资源的有效利用。因此该工艺将是未来紫杉醇产业中不可缺少的工艺之一。但由于可再生资源中其他有用紫杉烷含量较低，因此整体利用价值不高，导致7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的来源成为制约该工艺的主要因素。利用植物细胞培养方法生产紫杉醇因其生产周期短、可控性强、不破坏资源等优点日益受到重视。但传统工艺更多关注的是紫杉醇含量的高低，由于紫杉醇毒性高，水溶性差的特点，导致产率达到一个极限值后很难再有所突破。7-木糖-10-去乙酰紫杉醇是紫杉醇代谢路径上的一个中间化合物，其水溶性是紫杉醇10倍以上，而毒性是紫杉醇的1/10，在理论上，应该是一个更容易在细胞中累积的化合物。因此利用植物细胞培养的方法获得7-木糖-10-去乙酰紫杉醇应该是一个有效的方法，但遗憾的是之前并无这方面的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种生产7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的方法及其专用培养基。本发明提供了一种基本培养基，该培养基的配方为：NH₄NO₃xa01100-1300mg，KNO₃xa01800-2000mg，KH₂PO₄xa0320-360mg，CaCl₂·2H₂Oxa0420-460mg，MgSO₄·7H₂Oxa0350-380mg，FeSO₄·7H₂Oxa026-29mg，Na₂-EDTAxa036-38mg，MnSO₄·4H₂Oxa02.0-2.5mg，H₃BO₃xa00.5-0.7mg，KIxa00.7-0.9mg，Na₂MoO₄·2H₂Oxa00.02-0.03mg，CuSO₄·5H₂Oxa00.002-0.003mg，CoCl₂·6H₂Oxa00.002-0.003mg,Zn·Na-EDTAxa012-17mg，盐酸硫胺素0.4-0.6mg，烟酸0.4-0.6mg，盐酸吡哆醇0.4-0.6mg，甘氨酸1-3mg，用水定容至1L，pH5.6-5.8。本发明还提供了利用所述培养基生产7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的方法，该方法步骤如下：1）无菌条件下，将红豆杉的外植体在体积百分浓度70%的乙醇中消毒30s，再将其置于质量百分浓度为10%的次氯酸钠中杀菌20min，用无菌水冲洗3次，接种前将外植体切成长度为5mm的小段，将其接种于愈伤组织诱导培养基中在24℃，黑暗条件下诱导愈伤组织；2）将愈伤组织接种于继代培养基中在24℃，黑暗条件下进行继代培养。本发明提供的生产7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的方法，所述愈伤组织诱导培养基为在权利要求1所述的基本培养基的基础上添加2,4-Dxa01-7mg，蔗糖20-50g，琼脂5-8g/L。本发明提供的生产7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的方法，所述继代培养基为在权利要求1所述的基本培养基的基础上添加2,4-Dxa01-5mg，蔗糖20-50g，琼脂5-8g/L。本发明提供的生产7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的方法，所述红豆杉为南方红豆杉、云南红豆杉或中华红豆杉。本发明提供的生产7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的方法，所述外植体为茎、针叶或雄花。本发明提供的生产7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的方法，所述步骤2）中的继代培养周期为3-4周，至少继代4次。本发明的优点是：1.本发明首次提出利用植物组织培养的方法获得7-木糖-10-去乙酰紫杉醇，作为原料，7-木糖-10-去乙酰紫杉醇来源的探索对于紫杉醇的生产具有重要意义。2.用红豆杉愈伤组织代替叶片，保护了环境资源。3.植物细胞培养生长周期短、不受季节限制、成本低，所需劳动力少。
附图说明
图1.愈伤组织中7-木糖-10-去乙酰紫杉醇液相色谱图；图2.愈伤组织中7-木糖-10-去乙酰紫杉醇质谱图。
具体实施方式
下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。实施例1：利用南方红豆杉嫩茎培养获得7-木糖-10-去乙酰紫杉醇基本培养基：NH₄NO₃xa01300mg，KNO₃xa02000mg，KH₂PO₄xa0360mg，CaCl₂·2H₂Oxa0460mg，MgSO₄·7H₂Oxa0380mg，FeSO₄·7H₂Oxa029mg，Na₂-EDTAxa038mg，MnSO₄·4H₂Oxa02.5mg，H₃BO₃0.7mg，KIxa00.9mg，Na₂MoO₄·2H₂Oxa00.03mg，CuSO₄·5H₂Oxa00.003mg，CoCl₂·6H₂Oxa00.003mg,Zn.Na-EDTAxa017mg，盐酸硫胺素0.6mg，烟酸0.6mg，盐酸吡哆醇0.6mg，甘氨酸3mg，用水定容至1L，pH5.8。愈伤组织诱导培养基：是在基本培养基的基础上添加2,4-Dxa07mg，蔗糖50g，琼脂8g/L。继代培养基：是在基本培养基的基础上添加2,4-Dxa05mg，蔗糖50g，琼脂8g/L。上述培养基的灭菌条件均为：在121℃灭菌20min。现用本发明的方法对南方红豆杉进行培养，对获得的7-木糖-10-去乙酰紫杉醇进行提取和测定，具体方法包括以下步骤：1）外植体的消毒灭菌无菌条件下，将红豆杉嫩茎在体积百分浓度70%的乙醇中消毒30s，再将其置于质量百分浓度为10%的次氯酸钠中杀菌20min，用无菌水冲洗3次。2）诱导愈伤组织无菌条件下，将步骤1）经表面杀菌的外植体切成长度为5mm的小段，将其接种于愈伤组织诱导培养基中在24℃，黑暗条件下诱导愈伤组织，约3周后白色愈伤组织长出。3）继代培养将愈伤组织接种于继代培养基上在24℃，黑暗条件下进行继代培养，继代培养周期为3周，继代4次后，愈伤组织结构变疏松，生长速度趋于稳定，对其进行含量检测。4）7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的提取和测定将培养好的愈伤组织0.45g取出，至于55℃，-0.1MPa下干燥至恒重，获得干重为60mg的样品，用5ml甲醇分5次超声提取，每次超声时间30min，静置过夜后将提取液离心，上清50℃，-0.08MPa下蒸干。蒸干样品用1200ul甲醇溶解，进行LC-MS分析。分析测得7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的含量为0.005%。实施例2：利用云南红豆杉针叶培养获得7-木糖-10-去乙酰紫杉醇基本培养基：NH₄NO₃xa01200mg，KNO₃xa01900mg，KH₂PO₄xa0340mg，CaCl₂·2H₂Oxa0440mg，MgSO₄·7H₂Oxa0370mg，FeSO₄·7H₂Oxa027.8mg，Na₂-EDTAxa037.3mg，MnSO₄·4H₂Oxa02.23mg，H₃BO₃xa00.63mg，KIxa00.83mg，Na₂MoO₄·2H₂Oxa00.025mg，CuSO₄·5H₂Oxa00.0025mg，CoCl₂·6H₂Oxa00.0025mg，Zn.Na-EDTAxa015mg，盐酸硫胺素0.5mg，烟酸0.5mg，盐酸吡哆醇0.5mg，甘氨酸2mg，用水定容至1L，pH5.8。愈伤组织诱导培养基：是在基本培养基的基础上添加2,4-Dxa06mg，蔗糖40g，琼脂6g/L。继代培养基：是在基本培养基的基础上添加2,4-Dxa04mg，蔗糖40g，琼脂6g/L。上述培养基的灭菌条件均为：在121℃灭菌20min。现用本发明的方法对云南红豆杉进行培养，对获得的7-木糖-10-去乙酰紫杉醇进行提取和测定，具体方法包括以下步骤：1）外植体的消毒灭菌无菌条件下，将红豆杉针叶在体积百分浓度70%的乙醇中消毒30s，再将其置于质量百分浓度为10%的次氯酸钠中杀菌20min，用无菌水冲洗3次。2）诱导愈伤组织无菌条件下，将步骤1）经表面杀菌的外植体切成长度为5mm的小段，将其接种于愈伤组织诱导培养基中在24℃，黑暗条件下诱导愈伤组织，约3周后白色愈伤组织长出。3）继代培养将愈伤组织接种于继代培养基上在24℃，黑暗条件下进行继代培养，继代培养周期为3周，继代5次后，愈伤组织结构变疏松，生长速度趋于稳定，对其进行含量检测。4）7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的提取和测定将培养好的愈伤组织0.48g取出，至于55℃，-0.1MPa下干燥至恒重，获得干重为63mg的样品，用5ml甲醇分5次超声提取，每次超声时间30min，静置过夜后将提取液离心，上清50℃，-0.08MPa下蒸干。蒸干样品用1200ul甲醇溶解，进行LC-MS分析。分析测得7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的含量为0.009%。实施例3：利用中华红豆杉雄花培养获得7-木糖-10-去乙酰紫杉醇基本培养基：NH₄NO₃xa01100mg，KNO₃xa01800mg，KH₂PO₄xa0320mg，CaCl₂·2H₂Oxa0420mg，MgSO₄·7H₂Oxa0350mg，FeSO₄·7H₂Oxa026mg，Na₂-EDTAxa036mg，MnSO₄·4H₂Oxa02.0mg，H₃BO₃xa00.5mg，KIxa00.7mg，Na₂MoO₄·2H₂Oxa00.02mg，CuSO₄·5H₂Oxa00.002mg，CoCl₂·6H₂Oxa00.002mg，Zn.Na-EDTAxa012mg，盐酸硫胺素0.4mg，烟酸0.4mg，盐酸吡哆醇0.4mg，甘氨酸1mg，用水定容至1L，pH5.6。愈伤组织诱导培养基：是在基本培养基的基础上添加2,4-Dxa06mg，蔗糖20g，琼脂5g/L。继代培养基：是在基本培养基的基础上添加2,4-Dxa01mg，蔗糖20g，琼脂5g/L。上述培养基的灭菌条件均为：在121℃灭菌20min。现用本发明的方法对中华红豆杉进行培养，对获得的7-木糖-10-去乙酰紫杉醇进行提取和测定，具体方法包括以下步骤：1）外植体的消毒灭菌无菌条件下，将红豆杉雄花在体积百分浓度70%的乙醇中消毒30s，再将其置于质量百分浓度为10%的次氯酸钠中杀菌20min，用无菌水冲洗3次。2）诱导愈伤组织无菌条件下，将步骤1）经表面杀菌的外植体接种于愈伤组织诱导培养基中在24℃，黑暗条件下诱导愈伤组织，约4周后白色愈伤组织长出。3）继代培养将愈伤组织接种于继代培养基上在24℃，黑暗条件下进行继代培养，继代培养周期为4周，继代7次后，愈伤组织结构变疏松，生长速度趋于稳定，对其进行含量检测。4）7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的提取和测定将培养好的愈伤组织0.42g取出，至于55℃，-0.1MPa下干燥至恒重，获得干重为58mg的样品，用5ml甲醇分5次超声提取，每次超声时间30min，静置过夜后将提取液离心，上清50℃，-0.08MPa下蒸干。蒸干样品用1200ul甲醇溶解，进行LC-MS分析。分析测得7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的含量为0.006%。